2019年7月22日，Nanopore平臺(tái)全新測(cè)序芯片R10到達(dá)百邁客實(shí)驗(yàn)室，百邁客將開(kāi)啟ONT平臺(tái)測(cè)序新征程！
近年來(lái)，由于三代測(cè)序相較于二代測(cè)序，擁有單分子無(wú)需擴(kuò)增，長(zhǎng)度長(zhǎng)等優(yōu)勢(shì)，因此在各組學(xué)研究中大放異彩。而作為三代測(cè)序的代表技術(shù)之一，Nanopore平臺(tái)因能獲得更長(zhǎng)讀長(zhǎng)，在基因組學(xué)研究中更是備受青睞。但相較于二代平臺(tái)，三代平臺(tái)測(cè)序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性一直是比較大的劣勢(shì)。本次Oxford Nanopore Technologies公司即將推出的R10芯片，則劍指準(zhǔn)確性。相較于當(dāng)前廣泛使用的R9.4.1芯片，新型R10芯片可提供相當(dāng)?shù)淖x長(zhǎng)，產(chǎn)量及更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。
R10芯片測(cè)序原理
新升級(jí)R10芯片大的更新是納米孔采用了雙讀取器（Reader）的設(shè)計(jì)，能夠?qū)ν粔A基進(jìn)行兩次信號(hào)識(shí)別。理論上，同一堿基的識(shí)別次數(shù)為R9.4.1版本芯片2倍，由此來(lái)增加堿基的判斷率，減小隨機(jī)錯(cuò)誤，并提高一致準(zhǔn)確性。R10與R9.4.1測(cè)序方式比較如圖1
圖1??測(cè)芯片更新前后測(cè)序方式比較
01、單reads測(cè)序準(zhǔn)確性：
目前主流的R9.4.1芯片的表現(xiàn)能力如何？我們隨機(jī)抽取了200個(gè)已經(jīng)完成常規(guī)ONT DNA測(cè)序的樣品（包含各種動(dòng)植物）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，總共約22.4T數(shù)據(jù)（足夠有代表性了），結(jié)果如下：
可以看到，R9.4.1芯片數(shù)據(jù)的讀長(zhǎng)是非常理想的：Reads N50高達(dá)到72 Kb，平均達(dá)到35 Kb；單分子讀長(zhǎng)高達(dá)到了1.6 Mb；而關(guān)于質(zhì)量值平均為8.3，對(duì)應(yīng)準(zhǔn)確性為：85.21%；單個(gè)樣品平均質(zhì)量值高達(dá)到9.7，對(duì)應(yīng)準(zhǔn)確性為：89.28%；
R10的質(zhì)量表現(xiàn)如何呢？我們統(tǒng)計(jì)了拿到的四個(gè)樣品的數(shù)據(jù)，具體統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)下圖：
圖2 R10數(shù)據(jù)質(zhì)量值分布
絕大部分R10 reads的質(zhì)量值達(dá)到了10以上（對(duì)應(yīng)準(zhǔn)確性為90.0%），而平均質(zhì)量值為12.1（對(duì)應(yīng)準(zhǔn)確性為93.8%），而reads質(zhì)量值已經(jīng)達(dá)到了15以上(對(duì)應(yīng)準(zhǔn)確性為96.84%)。由此可見(jiàn)，對(duì)于單條reads來(lái)說(shuō)，提升還是非常明顯的，平均reads準(zhǔn)確性從85%提升到了93.8%。
02、Consensus序列準(zhǔn)確：
看完單條reads準(zhǔn)確性后，那么組裝時(shí)用到的高深度consensus序列準(zhǔn)確性怎么樣呢？官方比較了同一樣本不同芯片測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，見(jiàn)圖3。從結(jié)果可知，相同測(cè)序深度的情況下，consensus后序列的準(zhǔn)確性Q值，R10比R9.4.1提升了5~10之間，對(duì)應(yīng)的準(zhǔn)確性有的提升了1個(gè)百分點(diǎn)之多。
圖3?不同物種中R10和R9.4.1 reads準(zhǔn)確度
從官方的數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)數(shù)據(jù)深度為50X時(shí)，R10測(cè)序數(shù)據(jù)的consensus序列的準(zhǔn)確性已經(jīng)達(dá)到了Q44，即99.996%以上（圖4）。且隨著測(cè)序深度的增加，R10芯片一致準(zhǔn)確性逐漸增加。官方對(duì)多物種測(cè)試發(fā)現(xiàn)，在100X的測(cè)序深度下，consensus準(zhǔn)確性可以保持在Q45以上，在有些樣本上甚至已達(dá)到Q50（99.999％）水平（圖4），當(dāng)然加大測(cè)序深度也可以想要達(dá)到更高水平，測(cè)試結(jié)果中，最高已經(jīng)達(dá)到了Q52（99.9994%）。需要注意的是，這都是未經(jīng)過(guò)二代測(cè)序數(shù)據(jù)矯正的結(jié)果！
圖4 ?不同測(cè)序深度下R10 consensus序列準(zhǔn)確性比較
03、同聚物識(shí)別準(zhǔn)確性：
同聚物的識(shí)別準(zhǔn)確性是大家一直都比較關(guān)心的問(wèn)題，從ONT官方釋放的測(cè)試結(jié)果顯示，相比于R9.4.1，R10版本芯片能夠顯著提高其在同聚物區(qū)域的堿基識(shí)別準(zhǔn)確度，并且?guī)缀醪粫?huì)引入缺失錯(cuò)誤（圖5）。
圖5 R10、R9.4.1芯片在同聚物區(qū)域的測(cè)序準(zhǔn)確度
04、數(shù)據(jù)錯(cuò)誤分布：
官方通過(guò)檢測(cè)同一樣本R10和R9.4.1中的錯(cuò)誤在基因組上的情況，發(fā)現(xiàn)R9.4.1與R10的錯(cuò)誤在基因組上分布并不是完全重疊的，通過(guò)兩種版本芯片的數(shù)據(jù)進(jìn)行混合分析，可極大地提高序列的準(zhǔn)確性（圖6）。這表明了，在不使用二代數(shù)據(jù)的前提下，后續(xù)也可考慮通過(guò)R10和R9.4.1數(shù)據(jù)組合的方式來(lái)提高結(jié)果的準(zhǔn)確度！
圖6?R10和R9.4.1錯(cuò)誤分布情況
小結(jié)
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