PCR經(jīng)驗(yàn)分享

PCR(Polymerase chain reaction)即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種體外擴(kuò)增基因的技術(shù)或獲得目的基因片段的方法。在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中已占有及其重要的地位。隨著越來(lái)越多的基因研究，PCR已走進(jìn)了實(shí)驗(yàn)人的千家萬(wàn)戶(hù)。請(qǐng)讀者跟著小編的步伐，揭開(kāi)PCR的神秘面紗！

不少初入基因克隆的新手來(lái)說(shuō)，PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果常常不理想，別急，根據(jù)小編的經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)了大概有以下幾點(diǎn)的原因，或許會(huì)幫助屏幕前的你走出誤區(qū)：

PCR擴(kuò)增無(wú)目的條帶

這種結(jié)果的出現(xiàn)是所有失敗里面出現(xiàn)次數(shù)多的情況，比較好的方法就是嘗試更換引物，如果不是以下原因出現(xiàn)的話，引物的好壞決定了PCR實(shí)驗(yàn)的成敗。通常情況下，引物擴(kuò)增效率高的話，即便溫差在5度，都可以獲得很理想的結(jié)果，且特異擴(kuò)增。一般選擇引物GC含量在40%-60%，堿基數(shù)在19-23bp即可。GC含量高，可以減少堿基的數(shù)量，含量少，可以增加堿基的數(shù)量。

PCR出現(xiàn)非特異擴(kuò)增

這種情況的出現(xiàn)一般都是引物的特異性較差，或者也有可能是模板濃度太高，致使模板鏈數(shù)量太多，引物極易錯(cuò)誤配對(duì)，此時(shí)可適當(dāng)稀釋模板，應(yīng)該會(huì)有很好的效果，但還有一種極其特殊的情況，就是出現(xiàn)了污染。
常見(jiàn)污染來(lái)源：

1：槍桿的污染，這是實(shí)驗(yàn)室最常見(jiàn)的污染，由于上次吸液動(dòng)作劇烈，移液時(shí)會(huì)把上次污染源帶入到實(shí)驗(yàn)中，而PCR最容易受到微量液體的污染，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。

2：手套等外源核酸酶的污染，以及PCR體系的水一定選擇滅菌水。

PCR條帶弱

有目的條帶，但是濃度低，引物如果沒(méi)有問(wèn)題的話，那就是模板講解的原因。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)表明，模板最多不凍融超過(guò)兩次，四度溶解后保存不能超過(guò)一個(gè)星期，其實(shí)一個(gè)星期之內(nèi)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，條帶會(huì)逐漸減弱，七天之后就沒(méi)有了，所以模板的保存很重要。

巢式PCR（nested PCR）

巢式PCR就是利用PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物當(dāng)模板，在目的基因片段內(nèi)再設(shè)計(jì)一對(duì)嵌套引物，作為巢式PCR引物，此時(shí)經(jīng)過(guò)幾輪PCR后，目的擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度就會(huì)很高，但同時(shí)也會(huì)引入一些堿基突變。適用于基因表達(dá)量低的基因克隆或者提高目的片段的濃度，會(huì)有不錯(cuò)的效果。

半巢式PCR, 利用一個(gè)嵌套引物，而不是一對(duì)，原理同巢式PCR相似，都會(huì)使目的片段增亮幾個(gè)級(jí)別。

圖1 原始PCR產(chǎn)物

圖2 半巢式PCR產(chǎn)物

小編在做基因克隆時(shí)，如果要對(duì)圖1PCR產(chǎn)物送去測(cè)序，濃度會(huì)很低，達(dá)不到測(cè)序的濃度，當(dāng)時(shí)就利用半巢式PCR, 經(jīng)過(guò)切膠，成功獲得了目的片段序列。

產(chǎn)物保存

盡量不要在4度超過(guò)一天，DNA很容易降解，保存時(shí)間太長(zhǎng)的話會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生一定的影響，超過(guò)兩天很有可能就會(huì)使條帶消失。建議直接膠回收并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

在此，給大家介紹一款百邁客生物公司的 PCR Mix試劑盒–Biomarker HS 2X HF Master Mix，該產(chǎn)品具有以下特點(diǎn)：

高特異性

該試劑盒中的DNA聚合酶添加了能夠抑制酶活性的單克隆抗體，可進(jìn)行高特異性的熱啟動(dòng)PCR。

高保真性

該酶是具備高保真度的熱穩(wěn)定DNA聚合酶之一，其保真度比Pyrococcus furiosus DNA聚合酶高6倍。

平末端擴(kuò)增產(chǎn)物

該酶具和3′-5’和有5′-3’持續(xù)合成活性酸外切酶活性，其擴(kuò)增產(chǎn)物為平末端。

操作簡(jiǎn)單

該預(yù)混液中僅需加入DNA 模板、引物和水即可進(jìn)行擴(kuò)增。

相關(guān)產(chǎn)品

百邁客試劑現(xiàn)貨發(fā)售；

買(mǎi)百邁客試劑用生物信息培訓(xùn)班火熱進(jìn)行中；

買(mǎi)百邁客試劑送全國(guó)功能基因組峰會(huì)注冊(cè)名額正在進(jìn)行中；

活動(dòng)詳情可咨詢(xún)百邁客駐地銷(xiāo)售。

百邁客試劑技術(shù)咨詢(xún)QQ：1608430349。