免疫組庫(Immune Repertoire,IR)是B/T淋巴細(xì)胞抗原受體多樣性檢測(cè),即BCR/TCR的多樣性。BCR和TCR一般由可變區(qū)(V區(qū))、多變區(qū)(D區(qū))、連接區(qū)(J區(qū))、恒定區(qū)(C區(qū))構(gòu)成, V(D)J區(qū)域在遺傳過程中發(fā)生重排或重組,形成大量不同的組合形式,導(dǎo)致BCR和TCR基因序列多樣性極其豐富,這些序列多樣性集合稱為免疫組庫。
單細(xì)胞免疫組庫測(cè)序(scVDJ-seq )是基于10x Genomics平臺(tái)的微流控和油滴包裹技術(shù),在單細(xì)胞水平同時(shí)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)和TCR/BCR多樣性,不但可以了解TCR/BCR克隆型,還可以聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)深入挖掘生命機(jī)理,為免疫組學(xué)研究提供更高效的平臺(tái),在腫瘤微環(huán)境、感染性疾病、自身免疫疾病等研究領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。
利用10× Genomics平臺(tái)完成單細(xì)胞的分離、反轉(zhuǎn)錄成cDNA后,將cDNA一分為二,同時(shí)進(jìn)行TCR/BCR的V(D)J建庫和5’單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本建庫,并連接測(cè)序引物,獲得每個(gè)細(xì)胞5’基因表達(dá)數(shù)據(jù)和V(D)J全長(zhǎng)序列信息,獲得數(shù)據(jù)進(jìn)行細(xì)胞亞群聚類、細(xì)胞表達(dá)特征、標(biāo)記分子篩選、免疫組庫克隆型等分析。
一般來說B細(xì)胞或者T細(xì)胞受體TCR/BCR傳統(tǒng)研究存在很多局限性,其建庫基于對(duì)TCR/BCR特征序列的捕獲,只能使用多重PCR、5’RACE來研究CDR3區(qū)域,無法獲得V(D)J基因全長(zhǎng)序列、重鏈輕鏈/αβ鏈配對(duì)信息、T/B細(xì)胞克隆之間的關(guān)系、受體與特定抗原之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系等。此外,傳統(tǒng)免疫組庫研究基于細(xì)胞群體,單個(gè)或少量細(xì)胞研究往往受限。自2015年10x Genomics 平臺(tái)的推出,大大加快了免疫組庫研究領(lǐng)域的應(yīng)用,同時(shí)實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞水平的高分辨,解決傳統(tǒng)方法的局限性,降低了單細(xì)胞免疫組庫研究的門檻。
10x Genomics | 5’RACE | 多重PCR | |
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檢測(cè)原理 | 多重PCR | 從低豐度的轉(zhuǎn)錄本快速擴(kuò)增cDNA的5‘末端 | 多重PCR |
擴(kuò)增區(qū)域 | 全長(zhǎng) | CDR | CDR3 |
雙鏈匹配 | 精準(zhǔn)匹配兩個(gè)BCR/TCR鏈對(duì) | 只能檢測(cè)TCR和BCR一條鏈的序列信息 | 只能檢測(cè)TCR和BCR一條鏈的序列信息 |
優(yōu)點(diǎn) | VDJ全長(zhǎng);
TCR/BCR同時(shí)檢測(cè); 一次分析上千個(gè)單細(xì)胞TCRα/β和BCR重鏈和輕鏈信息和基因表達(dá)重復(fù)性高 |
可最*程度避免PCR擴(kuò)增偏向性 | 不用打斷,數(shù)據(jù)完整 |
缺點(diǎn) | 組織樣本制備單細(xì)胞懸液比較復(fù)雜 | 操作繁瑣,實(shí)驗(yàn)打斷會(huì)丟失部分序列,重復(fù)性不如多重PCR | PCR擴(kuò)增偏向性 無法檢測(cè)V等位基因的突變信息 |
單細(xì)胞表達(dá) | 可同時(shí)獲得單細(xì)胞表達(dá)譜 | 無法實(shí)現(xiàn) | 無法實(shí)現(xiàn) |
通過單細(xì)胞免疫組庫測(cè)序獨(dú)特的V(D)J數(shù)據(jù),√確匹配完全相同的有效CDR3核酸系列的Cell barcodes組合在一起,稱為克隆型。單細(xì)胞免疫組庫測(cè)序可以分析CDR3克隆型及每個(gè)克隆型包含的細(xì)胞的數(shù)目。通過克隆型的鑒定可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)一步分群,并通過優(yōu)勢(shì)克隆尋找特殊的細(xì)胞類型,指導(dǎo)耐藥機(jī)制、疫苗抗體研發(fā)、腫瘤治療等方面研究,利于揭示免疫組庫克隆性、多樣性、抗原特異性和細(xì)胞微環(huán)境。
單細(xì)胞免疫組庫數(shù)據(jù)利用10x 官網(wǎng)軟件 Cell ranger V(D)進(jìn)行處理,主要有clontypes鑒定分析、樣本相關(guān)性、CDR3特征分析、 V/D/J基因使用頻率分析等。具體詳情見解析:10x單細(xì)胞免疫組庫VDJ數(shù)據(jù)分析就看它
了解腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的表型,對(duì)于癌癥進(jìn)展和免疫治療反應(yīng)的研究至關(guān)重要。研究者使用單細(xì)胞RNA測(cè)序分析了來自8位原發(fā)性乳腺癌患者的45,000個(gè)免疫細(xì)胞,觀察到正常免疫細(xì)胞與腫瘤組織中免疫細(xì)胞之間有顯著相似性,但后者針對(duì)腫瘤微環(huán)境出現(xiàn)特異性連續(xù)表型擴(kuò)展;并通過單細(xì)胞免疫組庫測(cè)序檢測(cè)另外27,000個(gè)T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)和T細(xì)胞受體(TCR)多樣性,結(jié)果揭示了TCR組合使用對(duì)表型多樣性的影響。單細(xì)胞免疫組庫和單細(xì)胞RNA數(shù)據(jù)聯(lián)合分析更有利于研究腫瘤微環(huán)境、尋找免疫治療的靶點(diǎn),輔助腫瘤診療。
文獻(xiàn)原文:Single-cell Map of Diverse Immune Phenotypes in the Breast Tumor Microenvironment. 2018, Cell, IF=38.637
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