研究背景：

細(xì)胞質(zhì)雄性不育（CMS，花粉不育但雌蕊能正常發(fā)育）是高等植物中的常見現(xiàn)象，表現(xiàn)為母系遺傳。CMS廣泛應(yīng)用于作物雜交育種，以避免額外的人力物力去人工去雄，因此，CMS具有重要的理論和商業(yè)價(jià)值。植物CMS是由核線粒體相互作用介導(dǎo)的，不育性狀的產(chǎn)生來自線粒體基因的表達(dá)，但不育性狀可以通過核恢復(fù)育性基因得到恢復(fù)，產(chǎn)生育性部分恢復(fù)的表型。目前造成育性不穩(wěn)定的遺傳修飾的分子機(jī)制仍然不清楚。本研究欲通過BSR的策略尋找引起玉米育性不穩(wěn)定的候選基因。

材料選取：

Jing724和 MD32（CMS-S：S型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系）為親本，雜交得到F1群體，再以Jing724為回交親本，構(gòu)建BC4群體，群體大小462。選取BC4群體中極端30個(gè)完全雄性不育植株的花粉，分別提取RNA，并等量混合構(gòu)建不育池S，同理選取30個(gè)育性部分恢復(fù)植株的花粉，構(gòu)建育性部分恢復(fù)池F。
測序平臺：Illumina HiseqTM2500，PE125
測序數(shù)據(jù)：150M clean reads

主要結(jié)果：

1、育性分析：FIL-B（育性不穩(wěn)定系）分為育性部分恢復(fù)的植株和完全不育植株，本項(xiàng)目所構(gòu)建的BC4群體462個(gè)子代中有14.9% 的植株為育性部分恢復(fù)的表型。育性部分恢復(fù)植株的花粉大小小于正?；ǚ?，大于完全不育植株的花粉（Fig 1.）。經(jīng)I2-KI染色后的不育花粉表現(xiàn)出形態(tài)的不規(guī)則和染色的異常（Fig 2.）。

Fig 1. FIL-B花粉展示

A：Jing724 和FIL-B （育性不穩(wěn)定系，包括育性部分恢復(fù)植株和完全不育植株） 在抽穗6天后的穗；B： A圖中各植株穗上的花粉. 其中紅色的標(biāo)尺代表 3 cm

Fig 2. I2-KI染色后的花粉

A: 正?；ǚ? B: 育性部分恢復(fù)花粉；C：不育花粉

2、顯微鏡下觀察花粉小孢子：在育性部分恢復(fù)的植株中只有一部分的小孢子呈現(xiàn)在正常形態(tài)，而在不育植株中無正常形態(tài)小孢子。（Fig 3.）

Fig 3. 花粉小孢子的顯微觀察
A: 正?；ǚ? B: 育性部分恢復(fù)花粉；C：不育花粉

3、混池間差異基因分析：本項(xiàng)目以B73為參考基因組，將F池和S池獲得的89M和61M clean reads進(jìn)行比對。F池和S池的唯一比對效率為72.79% 和69.17%，表達(dá)的基因數(shù)目分別為31,905和31,895。獲得混池間的差異基因數(shù)目3,672個(gè)，在F池中上調(diào)表達(dá)的有3548個(gè)，下調(diào)表達(dá)的有124個(gè)，這些基因共3540個(gè)通過NR, Swiss-Prot, GO, COG和 KEGG數(shù)據(jù)庫得到注釋。

4、BSR關(guān)聯(lián)分析：與參考基因組比對后，F(xiàn)池和S池分別獲得171,594和 170,820個(gè) SNP，選取混池間差異的SNP位點(diǎn)，進(jìn)行ED關(guān)聯(lián)分析，共得到5個(gè)候選區(qū)域（Fig 4.），結(jié)合數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果及轉(zhuǎn)錄組差異基因的結(jié)果，最終獲得12個(gè)候選基因（Table 2、Table 3）。

Fig 4. ED關(guān)聯(lián)分析結(jié)果圖
A: 各染色體上SNP的ED值; B: 2號染色體上SNP的ED值；C：各染色體上SNP經(jīng)擬合后的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果；B: 2號染色體上SNP經(jīng)擬合后的的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果，其中紅色的虛線代表閾值線（99百分位法計(jì)算得到），黑色的實(shí)線代表擬合曲線

5、關(guān)聯(lián)基因的qPCR驗(yàn)證：
本研究選取6個(gè)與蛋白相關(guān)的候選基因，通過qPCR的方法驗(yàn)證RNA-seq結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)在育性部分恢復(fù)和不育兩種表型中，這6個(gè)候選基因出現(xiàn)4-8倍不同水平的差異表達(dá)。

Fig 5. qPCR驗(yàn)證結(jié)果

6、KASP驗(yàn)證：
本研究選取BC4群體中50株育性部分恢復(fù)植株和50株不育植株，分別提取DNA，對候選的兩個(gè)蛋白基因共4個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行KASP驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在不同的表型下會出現(xiàn)不同的基因型，再次暗示這兩個(gè)基因很可能是與育性不穩(wěn)定相關(guān)。

Fig 6. KASP驗(yàn)證結(jié)果

文章亮點(diǎn)：

1、研究性狀雄性不育在育種工作中具有重大意義，算得上熱點(diǎn)研究。
2、BSR定位結(jié)果準(zhǔn)確：轉(zhuǎn)錄組BSR不僅能實(shí)現(xiàn)SNP水平的定位，同時(shí)能從基因的差異表達(dá)水平進(jìn)一步縮小候選范圍，定位結(jié)果相對精細(xì)。
3、驗(yàn)證內(nèi)容豐富：從RNA水平（qPCR）和DNA水平（KASP）驗(yàn)證，只為拿到候選基因。

參考文獻(xiàn)：

Su A, Song W, Xing J, et al. Identification of Genes Potentially Associated with the Fertility Instability of S-Type Cytoplasmic Male Sterility in Maize via Bulked Segregant RNA-Seq[J]. PloS one, 2016, 11(9): e0163489.